Techniques fondamentales en technologie de l'ADN recombinant

L'Hybridation de l'ADN

L'hybridation de l'ADN est un phénomène naturel et l'une des techniques fondamentales en technologie de l'ADN recombinant.

L'hybridation de l'ADN est le processus par lequel deux brins d'ADN simple brin, possédant une séquence de base complémentaire, se réunissent pour former une molécule d'ADN double brin correctement appariée.

Pourquoi l'hybridation est-elle fondamentale en biotechnologie ?

Elle permet d'identifier la présence d'un gène codant pour une protéine d'intérêt sur un chromosome. Pour ce faire, on utilise un test d'hybridation avec des sondes d'ADN.

Les sondes d'hybridation d'ADN

Une sonde d'ADN est un fragment artificiel d'ADN simple brin, marqué par radioactivité ou fluorescence, dont la séquence nucléotidique est complémentaire à la séquence du gène à détecter.

La détection d'une sonde d'ADN qui s'est hybridée est assurée par un grand nombre de méthodes, par exemple l'impression d'un film radiographique (autoradiographie).

Les sondes d'hybridation d'ADN sont utilisées pour la recherche spécifique d'un gène.

La technologie des biopuces (Puces à ADN)

Lorsque l'on souhaite analyser des milliers de gènes simultanément, on utilise des puces à ADN (biopuces). Cette technologie a révolutionné la génétique de la même manière que les puces de silicium ont révolutionné l'industrie informatique.

Les biopuces sont des lames de verre sur lesquelles sont fixés, dans chacune de leurs cellules microscopiques, un petit nombre de fragments de séquences d'ADN nucléotidique simple brin. Chaque fragment agit comme une sonde pour un gène particulier.

Les milliers de cellules microscopiques sont disposées en grille sur la lame de verre (la taille ne dépasse pas celle d'un timbre-poste). Cela permet le développement de milliers de réactions d'hybridation parallèles.

L'emplacement exact de chaque sonde sur la biopuce étant connu, tout fragment d'ADN qui s'hybride avec l'une d'elles peut être identifié comme un gène particulier en localisant simplement la position de la sonde à laquelle il est attaché.

Utilisations de la technologie des biopuces

• Détecter les mutations dans les gènes qui causent des maladies comme l'hémophilie, la fibrose kystique, la maladie de Huntington et la dystrophie musculaire de Duchenne.
• Contrôler l'expression des gènes dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines.
• Diagnostiquer des maladies infectieuses.
• Permettre un traitement de la toxicomanie personnalisé, car les différences génétiques produisent différentes réactions individuelles aux traitements.
• Proposer de nouvelles techniques diagnostiques ou thérapeutiques.

Le clonage de l'ADN

Le mot clonage signifie produire des copies génétiquement identiques par reproduction asexuée. La population qui en résulte est appelée un clone. Mais qu'est-ce que ce mot signifie lorsqu'il est appliqué à l'ADN ?

Cloner un fragment d'ADN consiste à obtenir des milliards de copies identiques de ce fragment.

Méthode de clonage d'un fragment d'ADN

Pour cloner un fragment d'ADN, celui-ci doit être ajouté à une molécule porteuse, également appelée un vecteur.

Un vecteur de clonage est une petite molécule d'ADN capable d'entrer dans une bactérie et de s'y auto-reproduire. Les vecteurs de clonage les plus utilisés sont les plasmides bactériens.

La méthode de clonage est la suivante :

1. Le plasmide et l'ADN à cloner sont coupés avec la même enzyme de restriction.
2. Les fragments d'ADN et les plasmides coupés sont incubés ensemble pour former des plasmides recombinants.
3. Les plasmides recombinants sont incubés avec une culture bactérienne (habituellement Escherichia coli) dans des conditions appropriées pour que chaque bactérie incorpore un seul plasmide recombinant. Ce processus est appelé transformation.
4. Comme les plasmides sont porteurs d'un gène qui confère une résistance à un antibiotique, les bactéries traitées peuvent être sélectionnées en les plaçant dans des boîtes de culture contenant l'antibiotique. Seules les bactéries portant le plasmide recombinant seront résistantes, capables de survivre et de former des colonies sur les plaques. Les autres, qui n'ont pas été transformées, mourront.
5. Chaque colonie de bactéries transformées est isolée et maintenue dans des conditions de croissance. Lorsque les bactéries se dédoublent, le nombre de plasmides recombinants et des fragments d'ADN insérés double également.

Les clones obtenus forment ce qu'on appelle une banque d'ADN ou une bibliothèque génomique.

La Réaction en Chaîne par Polymérase (PCR)

Même à partir de très petites quantités, l'ADN peut être copié ou amplifié plusieurs fois à l'intérieur d'un tube à essai, sans nécessiter de clonage.

Cette technique est basée sur un processus appelé Réaction en Chaîne par Polymérase (PCR, de l'anglais Polymerase Chain Reaction).

La PCR est une réaction en chaîne qui génère des millions de copies d'un segment spécifique d'ADN en répétant plusieurs cycles de réplication de l'ADN in vitro.

Matériaux nécessaires pour la PCR

Le matériel de départ est l'ADN matrice à doubler, qui n'a pas besoin d'être purifié. Il faut également :

• Les quatre nucléotides.
• Deux molécules d'ADN courtes simple brin, appelées amorces, qui sont complémentaires aux séquences flanquant le gène d'ADN à copier.
• Une polymérase d'ADN résistant à la chaleur, comme la Taq (issue de la bactérie Thermus aquaticus, découverte près des geysers de Yellowstone), qui synthétise les nouveaux brins d'ADN.

Applications de la PCR

La PCR est un outil couramment utilisé pour amplifier des segments d'ADN provenant d'une grande variété de sources, par exemple :

• L'ADN de petites quantités de tissu, de sang ou de sperme prélevées sur une scène de crime.
• L'ADN de micro-organismes pathogènes.
• L'identification de l'ADN de cellules embryonnaires pour effectuer un diagnostic prénatal de maladies génétiques.